Transfeksi Plasmid DNA dengan Metode Kalsium-Fosfat

Bagi anda yang sedang bingung mencari metode transfeksi apa yang hendak anda gunakan untuk mentransfeksikan plasmid DNA anda, tidak ada salahnya mencoba metode Kalsium-Fosfat. Metode ini pertama kali diperkenalkan oleh Wigler dkk (Wigler et al, 1979) dan disempurnakan oleh Chen-Okayama (Chen and Okayama, 1987). Kelebihan dari metode ini adalah relatif murah dan mempunyai transformasi efisiensi yang cukup tinggi, baik untuk transfeksi transien maupun transfeksi stabil. Berikut adalah metode yang dipublikasikan oleh Chen dan Okayama, untuk transfeksi menggunakan petri yang berdiameter 35 mm.

Pertama, siapkan larutan 2xBBS (50 mM N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethane sulfonic acid (BES), 280 mM NaCl, dan 1,5 mM Na2HPO4). Ukur pHnya dengan pH meter pada suhu kamar (250C), dan buat serial larutan 2xBBS ber-pH 6,85 sampai 7,0 lalu sterilkan (dapat dengan fitrasi maupun dengan menggunakan autoclave). Untuk merubah pH dapat menggunakan larutan HCl atau NaOH. Setelah itu siapkan larutan 2,5 M CaCl2, sterilisasi dengan filtrasi.

Langkah kedua, tentukan pH optimum larutan 2xBBS untuk transfeksi. Kita bisa gunakan plasmid yang mengekspresikan b-galaktosidase atau lusiferase, atau protein/enzim lainnya yang dapat diukur secara kuantitatif. Prosedur untuk melakukan transfeksi metode Kalsium-Fosfat menurut Chen dan Okayama:

1. Siapkan sel yang akan ditransfeksi. Jika sel yang akan ditransfeksi bersifat adhesif (melekat pada dinding petri), siapkan sel tersebut 12-18 jam sebelum transfeksi. Jika sel yang akan ditransfeksi tidak bersifat adhesif, kita siapkan sel tersebut saat menjelang transfeksi. Untuk petri 35 mm, kita bisa siapkan 2 x 105 – 1 x 106 sel per petri (disesuaikan dengan ukuran sel). Sebaiknya menggunakan medium yang mengandung serum tapi tidak mengandung antibiotik.

2. Siapkan plasmid dengan konsentrasi 1 mg per 75 mL, gunakan eppendorf tube. Sebaiknya plasmid yang akan ditransfeksikan tersebut dilarutkan dalam mEq.

3. Tambahkan ke dalam no 2 di atas 8,3 mL larutan 2,5 M CaCl2 yang sudah disterilisasi, vortex selama 5-10 detik, biarkan dalam suhu kamar selama 5 menit.

4. Tambahkan 83,3 mL larutan 2xBBS pH X, vortex selama 5-10 detik, biarkan dalam suhu kamar selama 15 menit.

5. Teteskan seluruhnya (166,6 mL) secara hati-hati di atas sel yang sudah kita siapkan. Goyang atau miringkan petri ke kiri dan ke kanan beberapa kali, lalu masukkan kembali ke inkubator. Anda bisa masukkan ke inkubator 3% CO2 dulu selama beberapa jam lalu pindahkan ke inkubator 5% CO2 (direkomendasikan) atau langsung dimasukkan ke inkubator 5% CO2.

6. Setelah beberapa jam, panen sel, dan ukur aktifitas b-galaktosidase atau lusiferasenya.

7. Setelah diketahui larutan 2xBBS yang ber-pH berapa yang paling tinggi efisiensinya, gunakanlah larutan 2xBBS yang ber-pH tersebut untuk transfeksi selanjutnya. Larutan 2xBBS dapat disimpan di dalam kulkas 40C.

Tips:

1. Selalu gunakan larutan CaCl2 baru untuk setiap transfeksi. Meskipun dalam literatur tertulis kita dapat membuat stok larutan CaCl2 dan dapat disimpan di lemari pendingin -200C, pengalaman membuktikan efisiensi transfeksinya dapat berubah.

2. Hanya gunakan larutan 2xBBS dengan pH yang sudah dites. Jika stok dengan pH yang sudah dites tersebut habis, buat serial larutan 2xBBS ber-pH 6,85-7,00 baru, lalu tes ulang untuk mengetahui larutan 2xBBS yang ber-pH berapa yang paling tinggi efisiensinya. Dengan kata lain, misalkan pada pemeriksaan pertama diketahui larutan 2xBBS dengan pH 6,90-lah yang tingkat efisiensinya paling tinggi. Jika larutan ini habis, jangan langsung membuat larutan 2xBBS dengan pH 6,90 untuk transfeksi berikutnya karena belum tentu larutan 2xBBS ber-pH 6,90 baru ini mempunyai efisiensi yang sama dengan larutan 2xBBS pH 6,90 lama.

3. Tentukan pH optimum untuk masing-masing jenis sel.

Daftar Pustaka:

Claudia Chen and Hiroto Okayama. 1987. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol. Cell. Biol. 7(8):2745-2752.

Michael Wigler, Angel Pellicer, Saul Silverstein, Richard Axel, Gail Urlaub, and Lawrence Chasinii. 1979. DNA-mediated transfer of the adenine phosphoribosyltransferase locus into mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76(3): 1373-1376.

One Response to “Transfeksi Plasmid DNA dengan Metode Kalsium-Fosfat

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *


*

Skip to toolbar