Minipreparasi (ekstraksi plasmid DNA)

Salah satu tahap dalam pembuatan plasmid adalah minipreparasi. Disini, plasmid yang sudah kita buat melalui proses mutagenesis atau konstruk-bangun dengan menggunakan enzym restriksi-ligase kita kloning dengan menggunakan sel kompeten (misalnya E. coli). Caranya, plasmid kita transformasikan dahulu ke dalam sel kompeten tersebut (dengan metode Heat Shock atau dengan alat elektroporasi, misalnya). Setelah itu, sel kompeten yang sudah ditransformasi tersebut kita tumbuhkan di petri agar (untuk E. coli gunakan media LB) yang mengandung antibiotik yang sesuai. Koloni yang tumbuh di agar tersebut kita ambil dan kita tumbuhkan ke media cair (2 mL media TB untuk E.coli) yang mengandung antibiotik yang sesuai pula. Setelah 12-16 jam, plasmid DNA bisa kita panen. Proses ekstraksi plasmid DNA ini yang biasa disebut minipreparasi. Disebut mini karena jumlah sel kompeten yang dipanen sedikit. Meskipun banyak kit komersial untuk melakukan minipreparasi, tidak ada salahnya kita mengetahui metode konvensional tanpa kit. Berikut metode minipreparasi tanpa kit yang sering saya lakukan:

1. Pindahkan sel kompeten dalam media cair tersebut ke eppendorf tube (1,5 mL), pusingkan 14.000 rpm 1 menit, lalu buang supernatan. Hati-hati, jangan sampai pelet (sel kompeten) ikut terbuang.

2. Tambahkan 0,1 mL Larutan I (50 mM glukosa, 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA), vortex 1 menit sampai sel kompeten teresuspensi sempurna.

3. Tambahkan 0,2 mL Larutan II (0,2 N NaOH, 1% SDS), langsung lanjutkan ke tahap berikutnya (jangan di-vortex!).

4. Tambahkan 0,15 mL Larutan III ( 2 bagian 5 M asam asetat + 3 bagian 5 M CH3COOK), vortex selama 1 menit.

5. Tambahkan 0,1 mL phenol-chloroform-isoamylalkohol (25:24:1), vortex selama 1 menit.

6. Pusingkan 14.000 rpm selama 3 menit.

7. Kita akan mendapatkan 2 lapisan cairan. Pindahkan 0,42 mL cairan di lapisan atas (warna jernih) ke eppendorf tube yang baru. Sisa cairan jernih dan lapisan dibawahnya bisa kita buang.

8. Tambahkan 0,5 mL isopropanol ke dalam 0,42 mL cairan di atas. Campur dengan cara membolak-balikkan eppendorf tube tersebut.

9. Pusingkan 14.000 rpm selama 10 menit, buang supernatan. Hati-hati jangan sampai pelet yang berwarna putih (DNA) ikut terbuang.

10. Cuci dengan etanol 70% (sebaiknya etanol 70% ini didinginkan ke dalam lemari pendingin sebelum digunakan).

11. Pusingkan 14.000 rpm selama 5 menit, buang supernatan.

12. Keringkan dengan alat vakum atau balikkan eppendorf tube tersebut sampai semua etanol terbuang dan menguap.

13. Larutkan DNA dengan 0,1 mL TE (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA) yang sudah ditambahkan RNase A, masukkan ke inkubator 37 derajat Celcius selama 30 menit.

14. Plasmid DNA siap dianalisis dengan menggunakan enzym restriksi dan atau sekuensing.

Cukup mudah, bukan?

2 Responses to “Minipreparasi (ekstraksi plasmid DNA)

  • this is exactly the post I needed to see!

  • Assalamualaikum wr.wb, Mas Afie
    saya mau nanya maksud penggunaan etanol yang harus “didinginkan” apa ya? karena selama ini sy tidak pernah memggunakan etanol dingin untuk membilas plasmid. Thanks

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *


*

Skip to toolbar