Mempersiapkan Sel Kompeten Untuk Transformasi Metode CaCl2

Transformasi sel kompeten dengan menggunakan metode CaCl2 cukup efisien dan tidak membutuhkan peralatan khusus. Adapun sel kompeten E. coli yang akan digunakan harus dipersiapkan dahulu sebagai berikut:

1. Ambil 1 koloni E. coli, biakkan di 50 mL medium LB. Inkubasi di incubator shaker (250 rpm) 37 derajat Celcius selama 12-16 jam.

2. Ambil 4 mL dari kultur di atas, pindahkan ke dalam botol 1-2 liter yang berisi 400 mL medium LB (botol 2 liter lebih baik daripada botol 1 liter karena persediaan udara lebih banyak). Inkubasi di incubator shaker (250 rpm) 37 derajat Celcius, sampai mencapai OD 0,375 (wavelenght 590). Jangan sampai kultur mencapai OD 0,4 (wavelength 590), karena akan mengurangi transformasi efisiensi.

3. Bagi kultur tersebut menjadi 8, masukkan ke tabung polypropylene 50 mL yang sudah didinginkan terlebih dahulu di bak es. Biarkan tetap di dalam bak es selama 5-10 menit. Untuk tahap selanjutnya sel harus selalu dijaga agar dalam keadaan dingin (setiap langkah dilakukan di bak yang berisi es). Kita bisa menggunakan tabung atau botol yang lebih besar jika volume yang kita olah lebih besar daripada yang di atas (dengan catatan semua volume larutan yang lain juga ditingkatkan sesuai proporsinya).

4. Pusingkan sel 7 menit 3.000 rpm (1.600 x g), 4 derajat Celcius, tanpa brake.

5. Buang supernatan, dan lalu resuspen dengan 10 mL larutan CaCl2 (60 mM CaCl2, 15% glycerol, 10 mM PIPES pH 7) yang sudah didinginkan di dalam bak es. Hati-hati ketika membuang supernatan, jangan sampai sel ikut terbuang.

6. Pusingkan sel 5 menit 2.500 rpm (1.100 x g) 4 derajat Celcius. Buang supernatan dan resuspen dengan 10 mL larutan CaCl2 dingin. Biarkan di bak yang berisi es selama 30 menit.

7. Pusingkan sel selama 5 menit 2.500 rpm (1.100 x g), 4 derajat Celcius. Buang supernatan dan resuspen dengan 2 mL CaCl2 dingin. Perhatikan jenis sel kompeten kita. Untuk strain tertentu (misalnya DH1) kompetensi akan meningkat jika kita memperlama waktu inkubasi di bak es. Sedangkan strain yang lain (MC1061, misalnya) harus segera dimasukkan ke freezer sesegera mungkin. Saya pribadi lebih cenderung segera memasukkan sel kompeten ke freeser sesegera mungkin.

8. Buat aliquot 0,1-0,25 mL (Tergantung selera. Biasanya volume yang digunakan untuk transformasi 0,1 mL sel kompeten) di eppendorf tube yang sudah didinginkan di dalam bak es. Segera masukkan ke dalam freezer -80 derajat Celcius atau nitrogen cair sesegera mungkin.

Untuk metode transformasi plasmid DNA ke dalam sel kompeten E. coli metode CaCl2, silakan klik disini.

Catatan: Semua bahan dan alat yang digunakan harus dalam keadaan steril sebelum digunakan.

Daftar Pustaka:

Mandel, M. and Higa, A. 1970. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J. Mol. Biol. 53:159-162.

Ausubel, I. and Frederick, M. 1990. Current protocols in molecular biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *


*

Skip to toolbar