Mempersiapkan Sel Kompeten untuk Transformasi dengan Metode Elektroporasi

Elektroporasi dengan tegangan tinggi merupakan salah satu metode yang paling efisien dalam mentransformasikan plasmid DNA ke dalam sel kompeten. Saya pribadi lebih menyukai transformasi dengan metode ini dibandingkan metode lainnya. Adapun sel kompeten E. coli yang akan digunakan harus dipersiapkan terlebih dahulu, dengan metode Chen & Okayama, atau dengan metode berikut:

1. Inokulasi satu koloni tunggal E. coli ke dalam 5 mL media LB. Inkubasi di incubator shaker (250 rpm) 5-12 jam, 37 derajat Celcius.

2. Ambil 2.5 mL kultur di atas, lalu pindahkan ke dalam 500 mL media LB dalam botol 1-2 liter. Inkubasikan di incubator shaker (300 rpm) sampai mencapai OD 0,5-0,6 (wavelength 600).

3. Dinginkan sel dengan menggunakan ice-water bath, atau bak yang berisi es selama 10-15 menit. Mulai sekarang semua proses harus dijaga agar sel tetap dalam suhu 2 derajat Celcius. Pindahkan sel E. coli ke dalam tabung pemusing yang sudah didinginkan di bak es.

4. Pusingkan sel selama 20 menit, 4.200 rpm (Beckman J-6M atau yang ekuivalen), 2 derajat Celcius.

5. Buang supernatan, dan resuspen pelet dengan menggunakan air mEq dingin. Setelah sel teresuspensi dengan baik, tambahkan 500 mL air mEq dingin, campur dan lalu pusingkan selama 20 menit, 4.200 rpm (Beckman J-6M atau yang ekuivalen), 2 derajat Celcius. (TIPS: Agar pelet tidak mudah hilang ketika kita membuang supernatan di langkah ke-6, tambahkan 1 mM HEPES pH 7.0 dingin ke dalam tabung pemusing di langkah ke-5 ini).

6. Buang supernatan dan resuspen sel dengan menggunakan cairan yang tersisa.

7. Tambahkah 500 mL air mEq dingin, campur dengan baik, lalu pusingkan selama 20 menit, 4.200 rpm (Beckman J-6M atau yang ekuivalen), 2 derajat Celcius.

8. Buang supernatan dan resuspen pelet dengan menggunakan cairan yang tersisa.

9. Jika sel kompeten akan langsung digunakan untuk elektroporasi (Sel yang segar lebih baik daripada sel yang dibekukan), maka masukkan suspensi di atas ke dalam tabung pemusing 50 mL polypropylene, pusingkan selama 10 menit 4.200 rpm (Beckman J-6 M dengan rotor JS-4.2 dan adaptor, atau yang ekuivalen), 2 derajat Celcius. Perkirakan volume pelet yang ada (biasanya dari 500 mL kultur akan menghasilkan pelet sekitar 0,5 mL), tambahkan air mEq dingin dengan volume yang sama (jika volume pelet 0,5 mL, tambahkan 0,5 mL air mEq). Buat aliquot 0,05-0,3 mL ke dalam eppendorf tube yang sudah didinginkan di bak es.

10. Jika sel kompeten akan disimpan untuk digunakan di lain kesempatan, tambahkan 40 mL 10% gliserol yang sudah didinginkan, campur dengan baik, lalu pusingkan selama 10 menit 4.200 rpm (Beckman J-6 M dengan rotor JS-4.2 dan adaptor, atau yang ekuivalen), 2 derajat Celcius. Buang supernatan, perkirakan volume pelet, lalu tambahkan 10% gliserol dengan volume yang sama. Resuspen sel, lalu buat aliquot 0,05-0,3 mL ke dalam eppendorf tube yang sudah didinginkan di bak es, lalu simpan di lemari beku -80 derajat Celcius (jangan menggunakan nitrogen cair).

(Catatan: semua bahan dan alat yang digunakan harus dalam keadaan steril)

Daftar pustaka:

Ausubel, I. and Frederick, M. 1990. Current protocols in molecular biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience.

Baca Juga:

Mempersiapkan sel kompeten untuk transformasi metode Chung et al (One-step E. coli transformation)

Mempersiapkan sel kompeten untuk transformasi metode CaCl2

Memperbanyak sel kompeten

2 Responses to “Mempersiapkan Sel Kompeten untuk Transformasi dengan Metode Elektroporasi

  • assalamuailaikum

    thanks berat ya mas..

    penting banget ne info na..

    bolehkan link na di buat jd referensi??

    wassalam.

    jazaakaLLahu Khairan Katsiran

    afie: WassWrWb, silakan, Mas, mangga, mangga. Lagi bergelut dengan plasmid-kah?

  • mas, mEq itu apa sih? miliekuivalen?

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *


*

Skip to toolbar