Afie’s

Transformasi Plasmid DNA Metode Elektroporasi

Transformasi plasmid DNA metode elektroporasi setahu saya adalah metode transformasi yang paling efisien. Saya sendiri sering menggunakan metode ini, terutama untuk plasmid “sulit”. Metode ini juga dapat digunakan untuk mentransformasikan DNA ke dalam bakteri gram negatif dan positif lainnya (tidak hanya E. coli). Sayangnya alat ini butuh micropulser. Jadi bagi kita yang tidak punya alat ini, mungkin bisa menggunakan metode CaCl2 atau metode satu langkahnya Chung. Untuk transformasi metode elektroporasi, protokolnya bisa dibaca di brosur alat micropulser-nya, yang biasanya seperti ini:

1. Set micropulser 2,5 kV, 25 mF, 200-400 ohms. Untuk sel mamalia dan sel protoplast membutuhkan 0,5-8 kV/cm, sedangkan untuk E. coli sekitar 12,5 kV/cm.

2. Masukkan 5 pg – 500 ng DNA (dalam 1-2 mL) ke eppendorf tube yang berisi sel kompeten yang sudah disiapkan sebelumnya, baik dengan metode ini maupun metode ini. Campur dengan cara memipet secara lembut, jangan sampai ada gelembung udara!!!

3. Pindahkan DNA dan sel kompeten di atas ke dalam cuvette yang sudah didinginkan di bak es selama 5 menit, ketuk-ketuk perlahan agar campuran tersebut sampai ke dasar cuvette, lalu keringkan dinding luar cuvette dengan Kimwipe (sampai kering betul). JIka tidak ada Kimwipe boleh menggunakan tissue yang benar-benar halus.

4. Letakkan cuvette ke dalam sumurnya.

5. Tekan tombol pulse 5-10 detik (pada beberapa alat sampai terdengar bunyi “beep”).

6. Ambil cuvette dan segera masukkan 1 mL medium SOC dengan menggunakan pipet Pasteur, lalu segera pindahkan semuanya ke dalam 15 ml-PP tube. Inkubasi selama 30-60 menit (jangan sampai lebih dari 90 menit!) di incubator shaker (250 rpm) 37 derajat Celcius.

7. Sebarkan ke petri agar LB yang mengandung antibiotik yang sesuai.

Mudah, bukan?

Daftar Pustaka:

Ausubel, I. and Frederick, M. (eds). 1990. Current protocol in molecular biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience.

Calvin, HM. and Hanawalt, PC. 1988. High-efficiency transformation of bacterial cells by electroporation. J Bacteriol. 170:2796-2801.

Dower, WJ., Miller, JF., and Ragsdale, CW. 1988. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucl Acids Res. 16:6127-6145.

Baca Juga:

Mempersiapkan sel kompeten untuk transformasi metode elektroporasi

Transformasi plasmid DNA ke dalam sel kompeten metode CaCl2

Mempersiapkan sel kompeten untuk transformasi metode CaCl2

Memperbanyak sel kompeten

Minipreparasi (ekstraksi plasmid DNA)

December 19th, 2008 Posted by afie at 09:37am | Laboratorium | 3 comments